鹿茸多肽预处理通过miR-133a调控TGF-β/Smad信号通路对TBHP诱导心肌H9c2细胞损伤的保护作用

doi:10.13481/j.1671-587X.20230213

吉林大学学报(医学版) ›› 2023, Vol. 49 ›› Issue (2): 369-376.doi: 10.13481/j.1671-587X.20230213

鹿茸多肽预处理通过miR-133a调控TGF-β/Smad信号通路对TBHP诱导心肌H9c2细胞损伤的保护作用

周高峰¹,肖静^1,²,周佳¹,刘俊秀¹,律广富³,王雨辰¹,林贺¹(),黄晓巍¹()

^1.长春中医药大学药学院临床药学与中药药理教研室，吉林长春 130117
^2.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100094
^3.长春中医药大学吉林省人参研究科学院中药药理组，吉林长春 130117

收稿日期:2022-05-02 出版日期:2023-03-28 发布日期:2023-04-24
通讯作者: 林贺,黄晓巍 E-mail:linhe@ccucm.edu.cn;15948000740@163.com
作者简介:周高峰（1995－），女，内蒙古自治区通辽市人，在读硕士研究生，主要从事心血管及内分泌药理学方面的研究。
基金资助:
吉林省卫健委技术创新项目(2020J068);吉林省发改委创新能力建设项目(2021C011)

Protective effect of Velvet antler polypeptide pretreatment on myocardial H9c2 cell injury induced by TBHP through regulating TGF-β/Smad signaling pathway with miR-133a

Gaofeng ZHOU¹,Jing XIAO^1,²,Jia ZHOU¹,Junxiu LIU¹,Guangfu LYU³,Yuchen WANG¹,He LIN¹(),Xiaowei HUANG¹()

^1.Department of Clinical Pharmacy and Pharmacology of Chinese Medicine，School of Pharmacy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China
^2.Institute of Medicinal Plant Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100094，China
^3.Department of Pharmacology of Traditional Chinese Medicine，Jilin Ginseng Academy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China

Received:2022-05-02 Online:2023-03-28 Published:2023-04-24
Contact: He LIN,Xiaowei HUANG E-mail:linhe@ccucm.edu.cn;15948000740@163.com

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨鹿茸多肽（VAP）预处理对叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导大鼠心肌H9c2细胞损伤的保护作用，阐明VAP对miR-133a/转化生长因子β（TGF-β）/Smad轴的作用及其机制。方法将H9c2心肌细胞分为空白对照组、空白血清组、TBHP组、TBHP+低剂量（100 mg·kg^－1 ）VAP组、TBHP+高剂量（400 mg·kg^－1）VAP组和miR-133抑制剂（miR-133 inhibitor）组。空白对照组不做任何处理，其余各组细胞经VAP处理24 h后，给予200 μmol·L^－1 TBHP处理；miR-133 inhibitor 组细胞转染miR-133 inhibitor 24 h，给予400 mg·kg^－1 VAP处理24 h，并给予200 μmol·L^－1 TBHP处理。MTT法检测各组H9c2细胞存活率，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组细胞培养上清液中肌钙蛋白T（cTnT）、肌钙蛋白I（cTnI）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组H9c2细胞中miR-133表达水平，Western blotting法检测各组H9c2细胞中转化生长因子β1（TGF-β1）、磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）和Smad4蛋白表达水平。结果 MTT法检测，与TBHP组比较，TBHP+低剂量VAP组和TBHP+高剂量VAP组H9c2细胞存活率升高（P<0.05），miR-133 inhibitor 组H9c2细胞存活率差异无统计学意义（P>0.05）。ELISA法检测，与空白对照组比较，TBHP组H9c2细胞中cTnT、cTnI和CK-MB水平升高（P<0.05）；与TBHP组比较，TBHP+低剂量VAP组和TBHP+高剂量VAP组H9c2细胞中cTnT、cTnI和CK-MB水平降低（P<0.05）。RT-qPCR法检测，与空白对照组比较，TBHP组H9c2细胞中miR-133a表达水平降低（P<0.05）；与TBHP组比较，TBHP+低剂量VAP组和TBHP+高剂量VAP组H9c2细胞中miR-133a表达水平升高（P<0.05或P<0.01），miR-133 inhibitor 组H9c2细胞中 miR-133a表达水平明显降低（P<0.01）。Western blotting法检测，与空白对照组比较，TBHP组H9c2细胞中TGF-β1、p-Smad2/3和Smad4蛋白表达水平升高（P<0.05）；与TBHP组比较，TBHP+低剂量VAP组和TBHP+高剂量VAP组H9c2细胞中TGF-β1、p-Smad2/3和Smad4蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论 VAP预处理通过miR-133a调控TGF-β/Smad信号通路保护TPHP诱导的大鼠心肌H9c2细胞损伤。

关键词: 鹿茸多肽, 心肌损伤, 微小RNA-133a, 转化生长因子β, 血清药理学

Abstract:

Objective To explore the protective effect of velvet antler peptide （VAP） pretreatment on the myocardial H9c2 cell injury of the rats induced by tert-butyl hydroperoxide（TBHP）， and to clarify the effect of VAP on miR-133a/transforming growth factor-β（TGF-β）/Smad axis and its mechanism. Methods The H9c2 cells were divided into blank control group， blank serum group， TBHP group， TBHP+low dose（100 mg·kg^－1） of VAP group， TBHP+ high dose（400 mg·kg^－1） of VAP group， and miR-133 inhibitor（miR-133 inhibitor） group. The cells in blank control group were given no treatment， and the cells in the other groups were treated with VAP for 24 h， then were treated with 200 μmol·L^－1 TBHP； the cells in miR-133 inhibitor group were transfected with miR-133 inhibitor for 24 h，treated with 100 mg·kg^－1 VAP for 24 h+200 μmol·L^－1 TBHP. MTT assay was used to detect the survival rates of the H9c2 cells in various groups；the levels of troponin T（cTnT）， and cardial troponin T（cTnI）in culture supernatant of the cells in various groups were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） method and creatine kinase-MB（CK-MB）； the expression levels of miR-133 in the H9c2 cells in various groups were detected by real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） method；the expression levels of transforming growth factor-β1（TGF-β1），phosphorylated Smad2/3（p-Smad2/3）， and Smad4 proteins the in H9c2 cells in various groups were detected by Western blotting method. Results The MTT results showed that compared with TBHP group， the survival rates of H9c2 cells in TBHP+low dose of VAP group and TBHP+high dose of VAP group were increased （P<0.05）， but the survival rate of the H9c2 cells in miR-133 inhibitor group had no significant difference （P>0.05）. The ELISA assay results showed that compared with blank control group the levels of cTnT， cTnI，and CK-MB in the H9c2 cells in TBHP group were increased （P<0.05）； compared with TBHP group， the levels of cTnT， cTnI，CK-MB in the H9c2 cells in TBHP+low dose of VAP group and TBHP+high dose of VAP group were decreased （P<0.05）.The RT-qPCR results showed that compared with blank control group， the expression level of miR-133a in the H9c2 cells in TBHP group was decreased（P<0.05）；compared with TBHP group， the expression levels of miR-133a in the H9c2 cells in TBHP+ low dose of VAP group and TBHP+ high dose of VAP group were increased （P<0.05 or P<0.01），and the expression level of miR-133a in the cells in miR-133 inhibitor group was decreased（P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with blank control group， the expression levels of TGF-β1， p-Smad2/3， and Smad4 proteins in the H9c2 cells in TBHP group were increased（P<0.05）； compared with TBHP group， the expression levels of TGF-β1， p-Smad2/3， and Smad4 proteins in the H9c2 cells in TBHP+low dose of VAP and TBHP+ high dose of VAP groups were decreased （P<0.05）. Conclusion VAP pretreatment can protect the myocardial H9c2 cell injury of the rats induced by TBHP through regulating the TGF-β/Smad signaling pathway with miR-133a.

Key words: Velvet antler polypeptide, Myocardial injury, MicroRNA-133a, Transforming growth factor-β, Serum pharmacology

中图分类号:

R285.5

周高峰,肖静,周佳,刘俊秀,律广富,王雨辰,林贺,黄晓巍. 鹿茸多肽预处理通过miR-133a调控TGF-β/Smad信号通路对TBHP诱导心肌H9c2细胞损伤的保护作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2023, 49(2): 369-376.

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图/表 5

表1

表2

表3

表4

图1

参考文献 23

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Group	Survival rate
Group	5% serum containing drugs	10% serum containing drugs	20% serum containing drugs	24 h after treated with TBHP	48 h after treated with TBHP
Blank control	100.00±0.00	100.00±0.00	100.00±0.00	100.00±0.00	100.00±0.00
Blank serum	95.03±6.91	98.80±1.96	104.50±3.13	105.00±3.34	95.44±3.74
TBHP	－	－	－	61.55±3.64^*	45.90±3.09^*
TBHP+ low dose of VAP	63.53±2.11^*	75.20±2.73^*	82.08±3.51	83.08±2.73^△	64.35±2.47^△
TBHP+ high dose of VAP	68.34±4.41^*	75.28±3.18^*	86.89±4.46	94.14±3.68^△	76.90±5.22^△
miR-133 inhibitor	51.68±2.40^*	55.42±3.75^*	66.73±3.75^*	63.86±3.75	49.69±2.99

Group	cTnT[ρ_B/(pg·L^－1)]	cTnI[ρ_B/(pg·L^－1)]	CK-MB[ρ_B/(μg·L^－1)]
Blank control	15.27±2.46	53.72±4.97	11.27±1.98
Blank serum	16.56±1.97	56.12±1.66	11.33±1.37
TBHP	25.76±3.29^*	84.16±6.55^*	25.21±3.06^*
TBHP+ low dose of VAP	19.34±3.69^△	64.44±6.96^△	19.87±2.25^△△
TBHP+ high dose of VAP	17.66±3.26^△△	59.96±4.04^△△	15.45±1.32^△△
miR-133 inhibitor	24.33±3.34	75.66±8.20	22.72±1.34

Group	Expression leve of miR-133a
Blank control	1.00±0.00
Blank serum	0.97±0.14
TBHP	0.40±0.06^*
TBHP+ low dose of VAP	0.66±0.13^△
TBHP+ high dose of VAP	0.89±0.15^△△
miR-133 inhibitor	0.27±0.05^△△

Group	p-Smad2/3	TGF-β1	Smad4
Blank control	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
Blank serum	1.03±0.12	1.11±0.12	0.96±0.11
TBHP	4.31±0.34^*	2.92±0.36^*	2.81±0.24^*
TBHP+ low dose of VAP	2.14±0.35^△	1.86±0.15^△	1.32±0.35^△
TBHP+ high dose of VAP	2.83±0.32^△	1.96±0.22^△	1.47±0.32^△
miR-133 inhibitor	3.92±0.41	2.51±0.31	2.63±0.41

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鹿茸多肽预处理通过miR-133a调控TGF-β/Smad信号通路对TBHP诱导心肌H9c2细胞损伤的保护作用

Protective effect of Velvet antler polypeptide pretreatment on myocardial H9c2 cell injury induced by TBHP through regulating TGF-β/Smad signaling pathway with miR-133a

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