芦丁对肝细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587x.20200602

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨芦丁对肝癌HepG2细胞氧化应激损伤的保护作用，并阐明其作用机制。

方法

培养人肝癌HepG2细胞，取处于对数生长期的HepG2细胞分为对照组、叔丁基过氧化氢（TBHP）组（给予400 μmol·L^－1TBHP）和0.25、0.50、1.00 μmolL^－1芦丁组（给予0.25、0.50和1.00 μmol·L^－1芦丁+400 μmol·L^－1 TBHP）。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组HepG2细胞活性和各组肝癌HepG2细胞存活率，比色法检测各组肝癌HepG2细胞中丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）水平及超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用二氯荧光素乙酰乙酸盐（DCFH-DA）荧光染色法检测各组肝癌HepG2细胞中活性氧（ROS）水平，Western blotting法检测各组肝癌HepG2细胞中磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化AktB（p-Akt）、核转录因子κB（NF-κB）、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）和p53蛋白表达水平。

结果

MTT检测，芦丁摩尔浓度≤1 μmol·L^－1时，肝癌HepG2细胞的存活率均>90%，不显示细胞毒性；当芦丁摩尔浓度>1 μmol·L^－1时，肝癌HepG2细胞存活率逐渐降低，均<90%，显示细胞毒性。与对照组比较，TBHP组HepG2细胞存活率明显降低（P<0.01）；与TBHP组比较，不同浓度芦丁组HepG2细胞存活率明显升高（P<0.01）。比色法检测，与对照组比较，TBHP组肝癌HepG2细胞中MDA水平明显升高（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显降低（P<0.01）；与TBHP组比较，不同浓度芦丁组肝癌HepG2细胞中MDA水平明显降低（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显升高（P<0.01）。DCFH-DA染色，与对照组比较，TBHP组肝癌HepG2细胞中ROS水平明显升高；与TBHP组比较，不同浓度芦丁组肝癌HepG2细胞中ROS水平降低。Western blotting法检测，与对照组比较，TBHP组肝癌HepG2细胞中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达水平降低（P<0.05），NF-κB、p-NF-κB和p53蛋白表达水平升高（P<0.05）；与TBHP组比较，不同浓度芦丁组肝癌HepG2细胞中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达水平升高（P<0.05），NF-κB、p-NF-κB和p53蛋白表达水平降低（P<0.05）。

结论

芦丁对肝癌HepG2细胞损伤具有保护作用，其机制可能与调控PI3K/Akt和NF-κB两条信号通路有关联。

关键词: 芦丁, 叔丁基过氧化氢, 氧化应激, 肝细胞损伤, 肝细胞保护

Abstract: Objective

To explore the protective effect of rutin on the oxidative stress injury of liver cancer HepG2 cells， and to clarify its mechanism.

Methods

The liver cancer HepG2 cells in the logarithmic growth phase were divided into control group， tert-butyl hydroperoxide （TBHP） group （400 μmol·L^－1 TBHP）， 0.25， 0.50，and 1.00 μmol·L^－1 rutin groups （0.25， 0.50， 1.00 μmol·L^－1 rutin+400 μmol·L^－1 TBHP）. The vitalities of liver cancer HepG2 cells in various groups and the survival rates of liver cancer HepG2 cells in various groups were detected by MTT assay；the levels of malondialdehyde （MDA） and glutathione （GSH） and activities of superoxide dismutase （SOD） in the liver cancer HepG2 cells in various groups were assessed by colorimetric method； the levels of reactive oxidative species （ROS） in the liver cancer HepG2 cells in various groups were quantified with DCFH-DA immnofluorescence staining. The expression levels of PI3K， p-PI3K， Akt， p-Akt， NF-κB， p-NF-κB，and p53 proteins in the liver cancer HepG2 cells in various groups were mesured by Western blotting method.

Results

The MTT results showed that when the concentrations of rutin were less than or equal to 1.00 μmol·L^－1， the vitality of liver cancer HepG2 cells was higher than 90%， and the rutin had no toxic effect； when the concentration of rutin was higher than 1.00 μmol·L^－1， the vitality of the liver cancer HepG2 cells was lower than 90%，and the rutin had toxic effect. Compared with control group， the survival rate of the HepG2 cells in TBHP group was significantly decreased （P<0.01）； compared with TBHP group， the survival rates of the HepG2 cells in different concertrations of rutin groups were significantly increased （P<0.01）. Compared with control group， the level of MDA in the HepG2 cells in TBHP group was significantly decreased （P<0.01）， the level of GSH and the activity of SOD were significantly increased （P<0.01）； compared with TBHP group， the levels of MDA in the HepG2 cells in different concentrations of rutin groups were significantly increased（P<0.01）， the levels of GSH and the activities of SOD in the HepG2 cells in different concertrations of rutin groups were significantly decreased （P<0.01）. The results of DCFH-DA immunofluorescence staining showed that the ROS level in the HepG2 cells in TBHP group was higher than that in control group； compared with TBHP group， the ROS levels in the HepG2 cells in different concentrations of rutin groups were gradually decreased（P<0.05）. The Western blotting results showed that compared with control group， the expression levels of PI3K， p-PI3K， Akt， and p-Akt proteins in the HepG2 cells in TBHP group were decreased （P<0.05）， and the expressions levels of NF-κB， p-NF-κB，and p53 proteins were increased （P<0.05）； compared with TBHP group， the expressions levels of PI3K， p-PI3K， Akt， and p-Akt proteins in the HepG2 cells in different concentrations of rutin groups were increased （P<0.05）， and the expressions levels of NF-κB， p-NF-κB， and p53 proteins were decreased （P<0.05）.

Conclusion

Rutin has the protective effect on TBHP-induced HepG2 cell damage， and its mechanism may be related to the regulation of PI3K/Akt and NF-κB pathways.

Key words: rutin, tert-butyl hydroperoxide, oxidative stress, hepatocyte injury, hepatocyte protection

中图分类号:

R282.7

金芳多,张天,张钊,尹学哲,全吉淑. 芦丁对肝细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(6): 1117-1123.

Fangduo JIN,Tian ZHANG,Zhao ZHANG,Xuezhe YIN,Jishu QUAN. Protective effect of rutin on oxidative stress injury of HepG2 cells and its mechanism[J]. Journal of Jilin University(Medicine Edition), 2020, 46(6): 1117-1123.

图/表 7

图1

表1

表2

图3

图4

图5

图6

参考文献 24

1	崔香丹，何鑫，朱洁波，等. 草苁蓉多糖对氧化应激所致血管内皮细胞凋亡的抑制作用［J］. 食品科学， 2018， 39（9）： 127-133.
2	齐贵胜，裴素霞，任家胜. 曲克芦丁对四氯化碳致小鼠实验性肝损伤的保护作用［J］. 中医药学刊， 2006， 24（8）： 1539-1540.
3	ALSHARARI S D， AL-REJAIE S S， ABUOHASHISH H M， et al. Rutin attenuates hepatotoxicity in high-cholesterol-diet-fed rats［J］. Oxid Med Cell Longev， 2016， 2016： 5436745.
4	潘然，丁滨，胡林峰，等. 芦丁通过调控TG代谢途径抑制肝细胞脂肪变性的作用机制研究［J］. 云南中医学院学报， 2015， 38（5）： 1-6.
5	FEI J J， SUN Y， DUAN Y Y， et al. Low concentration of rutin treatment might alleviate the cardiotoxicity effect of pirarubicin on cardiomyocytes via activation of PI₃K/AKT/mTOR signaling pathway［J］. Biosci Rep， 2019， 39（6）： BSR20190546.
6	HU Y Y， WANG S P， WANG A Q， et al. Antioxidant and hepatoprotective effect of Penthorum chinense Pursh extract against t-BHP-induced liver damage in L02 cells［J］. Molecules， 2015， 20（4）： 6443-6453.
7	LI S， TAN H Y， WANG N， et al. The role of oxidative stress and antioxidants in liver diseases［J］. Int J Mol Sci， 2015， 16（11）： 26087-26124.
8	师腾瑞，李鸽，海春旭，等. 叔丁基过氧化氢诱导人正常肝细胞系L02自噬模型的建立及其线粒体应激机制［J］. 癌变·畸变·突变， 2016， 28（2）： 91-96.
9	刘晓岩，张超逸，王银叶，等. 6， 7-二乙酰黄芩素对四氯化碳和D-氨基半乳糖所致的急性肝损伤的保护作用［J］. 中国新药杂志， 2012， 21（13）： 1517-1522， 1527.
10	李琪. p38信号转导通路在芦丁联合奥沙利铂诱导胃癌细胞SGC-7901凋亡中作用的研究［D］. 锦州：锦州医科大学， 2018.
11	袁倩倩，赵海洲，马延红，等. 芦丁对MPP⁺诱导的SH-SY₅Y细胞损伤的保护作用［J］. 中国实验方剂学杂志， 2018， 24（16）： 109-114.
12	元海丹，李海燕，王瑜玲，等. 芦丁对HepG2肝癌细胞AMPK蛋白信号通路的激活作用［J］. 延边大学医学学报， 2013， 36（3）： 180-182.
13	赵杰,齐永芬,鱼艳荣.氧化应激在肝纤维化发生发展中的作用[J].临床肝胆病杂志,2019,35(9):2067-2071.
14	KUMAR D， SHANKAR S， SRIVASTAVA R K. Rottlerin induces autophagy and apoptosis in prostate cancer stem cells via PI₃K/Akt/mTOR signaling pathway［J］. Cancer Lett， 2014， 343（2）： 179-189.
15	GHONEUM A， SAID N. PI₃K-AKT-mTOR and NF-κB pathways in ovarian cancer： implications for targeted therapeutics［J］. Cancers （Basel）， 2019， 11（7）： E949.
16	YAN Y， LIANG Y， DING T， et al. PI3K/Akt signaling pathway may be involved in MCP-1-induced P2X4R expression in cultured microglia and cancer-induced bone pain rats［J］. Neurosci Lett， 2019， 701：100-105.
17	ALTOMARE D A， WANG H Q， SKELE K L，et al.AKT and mTOR phosphorylation is frequently detected in ovarian cancer and can be targeted to disrupt ovarian tumor cell growth［J］.Oncogene， 2004， 23（34）：5853-5857.
18	KUMAR A， PUROHIT R. Cancer associated E17K mutation causes rapid conformational drift in AKT1 pleckstrin homology （PH） domain［J］. PLoS One， 2013， 8（5）：e64364.
19	QIN H， DU X Y， ZHANG Y， et al. Platycodin D， a triterpenoid saponin from Platycodon grandiflorum， induces G2/M arrest and apoptosis in human hepatoma HepG2 cells by modulating the PI₃K/Akt pathway［J］. Tumour Biol， 2014， 35（2）： 1267-1274.
20	WANG S S， YAO Y Y， RAO C H， et al. 25-HC decreases the sensitivity of human gastric cancer cells to 5-fluorouracil and promotes cells invasion via the TLR2/NF-κB signaling pathway［J］. Int J Oncol， 2019， 54（3）： 966-980.
21	JIN H R， JIN S Z， CAI X F， et al. Cryptopleurine targets NF-κB pathway， leading to inhibition of gene products associated with cell survival， proliferation， invasion， and angiogenesis［J］. PLoS One， 2012， 7（6）： e40355.
22	VOBORIL R， WEBEROVA-VOBORILOVA J. Constitutive NF-kappaB activity in colorectal cancer cells： impact on radiation-induced NF-kappaB activity， radiosensitivity， and apoptosis［J］. Neoplasma， 2006， 53（6）： 518-523.
23	YIN L， YU X Z. Arsenic-induced apoptosis in the p53-proficient and p53-deficient cells through differential modulation of NFkB pathway［J］. Food Chem Toxicol， 2018， 118： 849-860.
24	YU X Z， ROBINSON J F， GRIBBLE E， et al. Gene expression profiling analysis reveals arsenic-induced cell cycle arrest and apoptosis in p53-proficient and p53-deficient cells through differential gene pathways［J］. Toxicol Appl Pharmacol， 2008， 233（3）： 389-403.

Group	Dose（μmol·L^－1）	A value	Survival rate（η/%）
Control		0.94±0.01	100.00±0.00
TBHP	400	0.518±0.04	48.68±1.74^*
Rutin	0.25	0.551±0.05	58.34±0.91^△
	0.50	0.63±0.09	60.72±0.68^△△
	1.00	0.699±0.03	66.84±2.12^△△

Group	Dose [с_B/(μmol·L^－1)]	MDA [с_B/(μmol·L^－1)]	SOD [λ_B/(U·mL^－1)]	GSH [m_B/(μmol·g^－1)]
Control		8.95±0.07	49.31±0.57	14.67±0.30
TBHP	400	13.57±0.00^*	10.49±0.07^*	4.66±0.24^*
Rutin	0.25	11.27±0.02^△△	16.44±0.79^△	7.32±0.03^△
	0.50	10.02±0.03^△△	24.37±0.43^△△	9.12±0.32^△△
1.00		8.89±0.05^△△	34.85±1.50^△△	13.65±0.80^△△

[1]	黄笑尘,李浩,王保华,李凯. 利多卡因对帕金森模型PC12细胞的保护作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(3): 638-647.
[2]	周阳,米旭光,蒲文星,汪文涛,景猛,孟繁凯. 褪黑素对过氧化氢诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧化应激的改善作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(2): 340-347.
[3]	陈素贤,谷泽慧,马炀斐,谭琦,李琪,王亚帝. 芦丁对人结肠癌SW480细胞凋亡的促进作用及其作用机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(2): 356-363.
[4]	崔磊华,侯玉帛,苏畅,李明贺,聂鑫. N-乙酰半胱氨酸对尼古丁诱导的MC3T3-E1细胞凋亡的作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(1): 26-32.
[5]	龚杰,雷泽华,张远威,黄雄,杜波,王志旭. miR-490-3p过表达对大鼠非酒精性脂肪性肝病的改善作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(6): 1495-1501.
[6]	王兴华,杨洪娟,胡秀红,崔红蕊,徐保振,李丹露,王涛,高玉伟. N-乙酰半胱氨酸对高尿酸血症大鼠氧化应激和血管内皮功能的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(5): 1209-1214.
[7]	周弟弥,甘露,陈琳,周成芳,曾良. 醉茄素A对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(4): 919-925.
[8]	赵展琦,张程锦,田娟. Ndfip1对铁离子诱导的神经细胞凋亡的抑制作用及其神经保护作用机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(2): 338-343.
[9]	张瑞丽,杨筱青,张晓鸽,郭华峰,朱继红. 妊娠期糖尿病对新生子代大鼠膈肌功能的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(1): 133-138.
[10]	李红芳,杨绍,曹莫寒,袁丽丽,李晓琎,史才兴,王茁桠,亚白柳. 姜黄素对高胆固醇血症模型大鼠脑微循环障碍的改善作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2021, 47(1): 53-58.
[11]	张聪, 刘迪, 张寒雪, 张浩, 孔繁利, 冯宪敏. 人参皂苷对过氧化氢诱导的HepG2细胞损伤的保护作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(05): 985-991.
[12]	杨帆, 李丽华. 维生素D受体激活对小鼠胆管结扎所致肝纤维化的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(04): 722-727.
[13]	秦超, 戴曦, 杨小琼, 王荣丽, 王星, 李国平. 和厚朴酚对哮喘小鼠肺组织炎症反应的干预作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(02): 214-220.
[14]	郭向辉, 郑慧, 吴巍. 白头翁皂苷B4对慢性肾功能衰竭大鼠肾组织的保护作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2020, 46(01): 90-95.
[15]	李金花, 金颖, 李俊峰, 李莉. 芝麻素对AD模型小鼠学习和记忆能力的影响及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2019, 45(06): 1275-1280.