重组人酸性成纤维细胞生长因子-穿膜肽融合蛋白的克隆表达、纯化及活性检测

J4 ›› 2010, Vol. 36 ›› Issue (5): 882-886.

重组人酸性成纤维细胞生长因子-穿膜肽融合蛋白的克隆表达、纯化及活性检测

张睿^1,2, 王晓杰¹, 王怡³, 田海山¹, 焦悦^1,2, 高丽昌¹, 李婷婷¹, 李校堃^1,3

1.吉林农业大学　生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,吉林长春 130118； 2.吉林农业大学中药材学院,吉林长春 130118； 3.温州医学院,浙江温州 325000

收稿日期:2010-04-19 出版日期:2010-09-28 发布日期:2010-09-28
通讯作者: 李校堃(Tel:0431-84533348,E-mail：xiaokunli@163.net) E-mail:xiaokunli@163.net
作者简介:张睿（1983-）|女|吉林省辽源市人|在读医学硕士|主要从事基因工程制药的研究。
基金资助:
国家863计划项目资助课题（2007AA100503）；教育部科技创新工程重大项目-培养资金项目资助课题(70S018)；吉林省科技发展计划项目资助课题（20070922）

Cloning,expression,purification and bioactivity assay of fusion protein of rhaFGF-tat

ZHANG Rui^1,2, WANG Xiao-Jie¹, WANG Yi³, TIAN Hai-Shan¹, JIAO Yue^1,2, GAO Li-Chang¹, LI Ting-Ting¹, LI Jiao-Kun^1,3

1.Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development|Ministry of Education,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2.College of Traditional Chinese Medicine,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;3.Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000,China

Received:2010-04-19 Online:2010-09-28 Published:2010-09-28

摘要/Abstract

摘要：

目的：高效表达并纯化具有生物学活性的重组人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)-穿膜肽(tat)融合蛋白，为进一步开发基因工程药物提供实验依据。方法:通过双酶切方法，从质粒pMD18-T-aFGF-tat中获得aFGF-tat基因片段，并将aFGF-tat融合基因与原核表达载体pET3c连接后转化到大肠杆菌BL21（DE3）宿主细胞中，通过IPTG诱导获得可溶性表达，将融合蛋白经CM离子交换层析与肝素亲和层析纯化，MTT法检测aFGF-tat融合蛋白对NIH 3T3细的促增殖作用。结果:经酶切和基因测序证实获得的重组人aFGF-tat基因序列与GenBank报道的完全一致，构建的pET3c-aFGF-tat表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达aFGF-tat融合蛋白，蛋白表达量在15%以上，经SDS-PAGE证实其相对分子质量与理论预期值相符，经CM离子交换层析与肝素亲和层析纯化后蛋白纯度高于95%，Western blotting分析表达产物与人aFGF多克隆抗体具有特异结合能力，并能够促进NIH 3T3细胞增殖。结论:成功表达重组人aFGF-tat融合蛋白工程菌，获得aFGF-tat纯蛋白，并证实aFGF-tat融合蛋白具有促细胞增殖活性。

关键词: 酸性成纤维细胞生长因子；穿膜肽；表达；纯化；活性检测

Abstract:

Abstract:Objective
To express and purify the fusion protein of rhaFGF-tat with biological activity,and provide a foundation for development of an genetically engineered drug. Methods The aFGF-tat gene fragment through digesting the pMD18-T-aFGF-tat was obtained,then the recombinant plasmid was transformed into E.coil BL21 (DE3) and induced by IPTG. The protein was purified by CM-Sepharose FF cation exchange and heparin-Sepharose FF affinity. The activity of aFGF-tat was detected with NIH 3T3 proliferation assay. Results Acquired gene fragments of aFGF-tat identified by digestion and DNA sequencing were coincident with the human aFGF-tat reported in GenBank. The recombinant vector of pET3c-aFGF-tat was constructed successfully. SDS-PAGE result proved that aFGF-tat fusion protein with a relative molecular mass of about 19 102 was expressed. The purity of fusion protein was more than 95%,Western blotting results showed that the expressed products had specific reaction with anti-human aFGF polyclonal antibody and was able to promote the proliferation of NIH 3T3 cells. Conclusion　aFGF-tat fusion gene is expressed in E.coil and purified successfully,and the aFGF-tat fusion protein can promote the proliferation of cells.

Key words: acidic fibroblast growth factor；transcriptional activator protein；expression；purification；activity assay

中图分类号:

张睿, 王晓杰, 王怡, 田海山, 焦悦, 高丽昌, 李婷婷, 李校堃. 重组人酸性成纤维细胞生长因子-穿膜肽融合蛋白的克隆表达、纯化及活性检测[J]. J4, 2010, 36(5): 882-886.

ZHANG Rui, WANG Xiao-Jie, WANG Yi, TIAN Hai-Shan, JIAO Yue, GAO Li-Chang, LI Ting-Ting, LI Jiao-Kun. Cloning,expression,purification and bioactivity assay of fusion protein of rhaFGF-tat[J]. J4, 2010, 36(5): 882-886.

[1]	周颖,高孟飞,朱慧勇. 间充质干细胞干性维持信号通路的研究进展[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 638-642.
[2]	李红，陈永浩，龚红君. 右美托咪定对肾癌根治术患者围术期炎性细胞因子和肾功能的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 588-591.
[3]	李海波，刘行，孙美花,梁建民. 孕期至幼年期低水平铅暴露仔鼠海马锌离子平衡的变化及其发育期海马神经元的损伤[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 521-528.
[4]	谢波，沈梅，叶文鑫，舒彦，梁臻，张心男. 依帕司他联合行为疗法治疗女性糖尿病膀胱的临床疗效评价[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 597-600.
[5]	李辉,赵丽晶,杜宇,杨铁铮，李国峰,陈亮,支晨阳,李娜,周建华. 结肠安栓联合舒血宁对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 488-493.
[6]	张洪长，王恩鹏，陈新，唐燕，王洪鑫，王炫策，许新. 人参皂苷Re对UVC辐射损伤细胞的保护作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 507-511.
[7]	武国东，王素侠，及志勇，张舒岩. 急性心力衰竭大鼠B型钠尿肽水平与肝功能的关系[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 517-520.
[8]	陈宣男，全首祯. NDM1基因常规PCR与荧光定量PCR检测方法的建立及其检测结果比较[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 625-629.
[9]	周超熙,于滨,赵斌,马志强,赵文河,于跃明. 直肠癌环周切缘病理学检测判断中低位直肠癌患者预后的临床价值[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 601-604.
[10]	周广宇，韩雪梅，金玲. 神经精神狼疮患者影像学表现与自身抗体水平和预后的关系[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 609-614.
[11]	周建英，田勇韩青,贺庆,程凯亮,李幼琼. 影像学三维重建技术在寰椎立体模型建立及性别鉴定中的应用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 605-608.
[12]	沈煜，沈惠良，方秀统. 老年股骨颈骨折患者关节置换术后死亡危险因素分析[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 574-577.
[13]	王宗谦，卢新星. 终末期肾病患者抑郁程度与生存质量各个维度之间的关系[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(3): 615-619.
[14]	李树春，王槐. 影响美托洛尔治疗效果的药物基因组学研究进展[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(2): 423-426.
[15]	刘欣，赵龙宇，刘聪，陈慧玲，刘晓冬，马淑梅. 极低频电磁辐射从业人员外周血细胞的变化及其意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39(2): 383-386.