过表达TLR4基因对胃癌细胞自噬的抑制作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20220518

摘要/Abstract

摘要：

目的采用慢病毒过表达胃癌细胞中Toll样受体4（TLR4）基因，探讨其对胃癌细胞自噬的作用，并阐明其作用机制。方法处于对数生长期的胃癌BGC-823细胞和SGC-7901细胞分为未感染组、阴性对照病毒组和基因过表达组，分别给予无慢病毒感染、空载体慢病毒和过表达TLR4慢病毒稳定感染。采用Western blotting法检测正常胃黏膜上皮GES-1细胞及胃癌BGC-823细胞、SGC-7901细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法分别检测各组细胞中TLR4、Beclin1和微管相关蛋白轻链3（LC3）mRNA表达水平，Western blotting法检测各组细胞中磷脂酰肌醇-3激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）、磷酸化PI3K／磷酸化Akt（p-PI3K／p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）信号通路相关蛋白及细胞自噬相关蛋白（LC3、Beclin1和p62）蛋白表达水平。结果 BGC-823细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平高于胃黏膜上皮GES-1细胞。与未感染组和阴性对照病毒组比较，过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较，过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞增殖活性明显升高（P<0.05或P<0.01）。与阴性对照病毒组比较，过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4 mRNA表达水平明显升高（P<0.01），BGC-823细胞中Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05），SGC-7901细胞中LC3和Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较，过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中LC3和Beclin1蛋白表达水平明显降低（P<0.05），p62、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论过表达TLR4基因可以通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路明显抑制胃癌细胞的自噬活性。

关键词: 胃肿瘤, Toll样受体4, 细胞自噬, 细胞增殖

Abstract:

Objective To investigate the effect of overexpression of Toll-like receptor 4 （TLR4） gene by lentivirus on autophagy of the gastric cancer cells，and to clarify its mechanism. Methods The gastric cancer cells BGC-823 and SGC-7901 at logarithmic growth phrase were divided into non-infection group，negative control virus group and over-expression TLR4 group； they were infected with lentivirus-free， empty vector and lentivirus that overexpress TLR4， separately. Western blotting method was used to detect the expression levels of TLR4 protein in gastric epithelial cells GES-1 and gastric cancer cells BGC-823， SGC-7901， HGC-27 and MGC-803.CCK-8 assay was used to detect the proliferation activities of cells in various groups，real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was performed to determine the expression levels of TLR4，Beclin1 and microtubule-associated protein light chain 3（LC3） mRNA，the expression levels of phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B （PI3K/Akt）， mammalian target of rapamycin （mTOR）， phosphorylated PI3K/phosphorylated Akt （p-PI3K/p-Akt） and phosphorylated mTOR （p-mTOR） signaling pathway-related proteins and autophagy-related proteins （LC3， Beclin1 and p62） were detected by Western blotting method. Results The expression levels of TLR4 protein in BGC-823 cells， HGC-27 cells and MGC-803 cells were higher than that in gastric epithelial cells GES-1.Compared with non-infection and negative control virus groups，the TLR4 protein expression levels in BGC-823 and SGC-7901 cells in over-expression TLR4 group were significantly increased（P<0.05）.Compared with non-infection control and negative control virus groups，the proliferation activities of BGC-823 cells and SGC-7901 cells in over-expression TLR4 group were significantly increased（P<0.05 or P<0.01）.Compared with negative control group，the expression levels of TLR4 mRNA in the BGC-823 cells and SGC-7901 cells in over-expression TLR4 group were significantly increased（P<0.01），the expression level of Beclin1 mRNA in BGC-823 cells was decreased（P<0.05），and the expression levels of LC3 and Beclin1 mRNA in SGC-7901 cells were decreased（P<0.05）.Compared with non-infection group and negative control group，the expression levels of LC3 and Beclin1 proteins in the BGC-823 cells and SGC-7901 cells in over-expression TLR4 group were significantly decreased（P<0.05），while the expression levels of p62， p-PI3K、p-Akt and p-mTOR proteins were increaed（P<0.05）. Conclusion The over-expression of TLR4 gene can significantly inhibit autophagy in gastric cancer cells via regulating the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Key words: Stomach neoplasms, Toll-like receptor 4, Autophagy, Cell proliferation

中图分类号:

R735.2

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Group	Proliferation activity of BGC-823 cells
Group	(t/h) 24	48	72	96	120
Non-infection	0.32±0.08	0.35±0.10	0.36±0.04	0.44±0.08	0.57±0.09
Negative control virus	0.31±0.09	0.33±0.08	0.39±0.05	0.48±0.07	0.63±0.07
Over-expreession TLR4	0.37±0.08	0.47±0.11	0.70±0.09	0.87±0.14^*△	1.13±0.18^*△

Group	Proliferation activity of SGC-7901 cells
Group	(t/h) 24	48	72	96	120
Non-infection	0.38±0.08	0.50±0.07	0.61±0.09	0.71±0.10	0.80±0.04
Negative control virus	0.37±0.07	0.49±0.08	0.60±0.09	0.73±0.09	0.79±0.04
Over-expreession TLR4	0.45±0.10	0.67±0.17	0.86±0.30	1.17±0.21^*△	1.33±0.15^**△△

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