小白菊内酯通过抑制Piezo1表达对机械牵张应力作用下软骨细胞凋亡的影响及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20240616

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨小白菊内酯（PTL）通过调控机械敏感性离子通道蛋白1（Piezo1）表达对机械牵张应力作用下软骨细胞凋亡的影响，并阐明其相关作用机制。方法按照拉伸性变量将软骨细胞分为0%、5%、10%、15%和20%拉伸组。另取软骨细胞，分为对照组、20%拉伸组、20%拉伸+ 5 μmol·L^-1 PTL组、20%拉伸+10 μmol·L^-1 PTL组和20%拉伸+20 μmol·L^-1 PTL组。使用Piezo1 短发夹RNA（shRNA）干扰慢病毒（sh-Piezo1）或shRNA-NC慢病毒感染软骨细胞，将软骨细胞分为sh-Piezo1组和sh-NC组，另设置空白对照组。另将软骨细胞分为20%拉伸组、20%拉伸+PTL组、20%拉伸+sh-Piezo1组和20%拉伸+sh-Piezo1+PTL组。Hoechst 33258荧光染色观察各组细胞核形态表现，流式细胞术检测各组细胞凋亡率，分光光度法检测各组细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3活性，CCK-8法检测各组细胞增殖率，Fluo-4/AM荧光探针法检测各组细胞中钙离子（Ca²⁺）水平，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中Piezo1 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组细胞中Piezo1蛋白表达水平。结果 Hoechst 33258荧光染色观察，随着拉伸量逐渐增加，0%、5%、10%、15%和20%拉伸组软骨细胞细胞核呈碎块状致密浓染的软骨细胞数量逐渐增加。流式细胞术检测，与0%拉伸组比较，5%、10%、15%和20%拉伸组软骨细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）；与对照组比较，20%拉伸组软骨细胞中细胞凋亡率明显升高（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+5 μmol·L^-1PTL组、20%拉伸+10 μmol·L^-1PTL组和20%拉伸+ 20 μmol·L^-1PTL组软骨细胞细胞凋亡率均明显降低（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+ PTL组和20%拉伸+ sh-Piezo1组软骨细胞凋亡率均明显降低（P<0.05）。分光光度法检测，与0%拉伸组表示，5%、10%、15%和20%拉伸组软骨细胞中Caspase-3活性均明显升高（P<0.01）；与对照组比较，20%拉伸组软骨细胞中Caspase-3活性明显升高（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+5 μmol·L^－1 PTL组、20%拉伸+10 μmol·L^－1 PTL组和20%拉伸+20 μmol·L^－1 PTL组软骨细胞中Caspase-3活性均明显降低（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+PTL组和20%拉伸+ sh-Piezo1组软骨细胞中Caspase-3活性均明显降低（P<0.05）。CCK-8法检测，与0 μmol·L^－1 PTL组比较，40.00、80.00和160.00 μmol·L^-1 PTL组软骨细胞增殖率均明显降低（P<0.05），提示20.00 μmol·L^-1 PTL为最高无毒性作用浓度。Fluo-4/AM荧光探针法检测，与对照组比较，20%拉伸组软骨细胞中Ca²⁺水平明显升高（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+5 μmol·L^－1 PTL组、20%拉伸+10 μmol·L^－1 PTL组和20%拉伸+20 μmol·L^－1 PTL组软骨细胞中Ca²⁺水平均明显降低（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+PTL组和20%拉伸+sh-Piezo1组软骨细胞中Ca²⁺水平均明显降低（P<0.05）。RT-qPCR法检测，与空白对照组和sh-NC组比较，sh-Piezo1组软骨细胞中Piezo1 mRNA表达水平明显降低（P<0.05）。Western blotting法检测，与对照组比较，20%拉伸组软骨细胞中Piezo1蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+5 μmol·L^－1 PTL组、20%拉伸+10 μmol·L^－1 PTL组和20%拉伸+20 μmol·L^－1 PTL组软骨细胞中Piezo1蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）；与空白对照组和sh-NC组比较，sh-Piezo1组软骨细胞中Piezo1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论 PTL可抑制高强度周期性机械牵张应力诱导的软骨细胞凋亡，其作用机制可能与抑制Piezo1介导Ca²⁺内流引起的细胞凋亡有关。

关键词: 小白菊内酯, 机械敏感离子通道蛋白1, 机械牵张应力, 软骨细胞, 细胞凋亡

Abstract:

Objective To discuss the effect of parthenolide （PTL） on the apoptosis of the chondrocytes under mechanical stretch stress by regulating the expression of piezo type mechanosensitive ion channel component 1（Piezo1）， and to clarify the related mechanism. Methods The chondrocytes were divided into 0%， 5%， 10%， 15%， and 20% stretch groups according to the stretch variable. Additionally， the chondrocytes were divided into control group， 20% stretch group， 20% stretch+5 μmol·L^-1 PTL group， 20% stretch+10 μmol·L^-1 PTL group， and 20% stretch+20 μmol·L^-1 PTL group. The Piezo1 short hairpin RNA （shRNA） interference lentivirus （sh-Piezo1） or shRNA-NC lentivirus were used to infect the chondrocytes， and the chondrocytes were divided into sh-Piezo1 group and sh-NC group， and also set up blank control group. The chondrocytes were also devided into 20% stretch group， 20% stretch+PTL group， 20% stretch+sh-Piezo1 group， and 20% stretch+sh-Piezo1+PTL group. Hoechst 33258 fluorescence staining was used to observe the morphology of the nuclear in various groups； flow cytometry was used to detect the apoptotic rates of the cells in various groups； spectrophotometry was used to detect the cysteinyl aspartate specific proteinase（Caspase）-3 activities in the cells in various groups； CCK-8 method was used to detect the proliferation rates of the cells in various groups； Fluo-4/AM fluorescent probe method was used to detect the calicium ion（Ca²⁺） levels in the cells in various groups； real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） method was used to detect the expression levels of Piezo1 mRNA in the cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of Piezo1 protein in the cells in various groups. Results The Hoechst 33258 fluorescence staining resuts showed that as the increasing of stretch， the number of the chondrocytes with fragmented and densely stained nuclei in 0%， 5%， 10%， 15%， and 20% stretch groups were gradually increased. The flow cytometry results showed that compared with 0% stretch group， the apoptotic rates of the chondrocytes in 5%， 10%， 15%， and 20% stretch groups were significantly increased （P<0.01）； compared with control group， the apoptotic rate of the chondrocytes in 20% stretch group was significantly increased （P<0.05）； compared with 20% stretch group， the apoptotic rates of the chondrocytes in 20% stretch+ 5 μmol·L^-1 PTL group， 20% stretch+10 μmol·L^-1 PTL group， and 20% stretch+20 μmol·L^-1 PTL group were significantly decreased （P<0.05）； compared with 20% stretch group， the apoptotic rates of chondrocytes in 20% stretch+PTL group and 20% stretch+sh-Piezo1 group were significantly decreased （P<0.05）. The spectrophotometry results showed that compared with 0% stretch group， the Caspase-3 activities in the chondrocytes in 5%， 10%， 15%， and 20% stretch groups were significantly increased （P<0.01）； compared with control group， the Caspase-3 activity in the chondrocytes in 20% stretch group was significantly increased （P<0.05）； compared with 20% stretch group， the Caspase-3 activities in the chondrocytes in 20% stretch+5 μmol·L^-1 PTL group， 20% stretch+10 μmol·L^-1 PTL group， and 20% stretch+20 μmol·L^-1 PTL group were significantly decreased （P<0.05）. Compared with 20% stretch group， the Caspase-3 activities in the chondrocytes in 20% stretch+PTL group and 20% stretch+ sh-Piezo1 group were significantly decreased （P<0.05）. The CCK-8 method results showed that compared with 0 μmol·L^-1 PTL group， the proliferation rates of the chondrocytes in 40.00， 80.00， and 160.00 μmol·L^-1 PTL groups were significantly decreased （P<0.05）， indicating that 20.00 μmol·L^-1 PTL was the maximum non-toxic concentration. The Fluo-4/AM fluorescent probe method results showed that compared with control group， the Ca²⁺ level in the chondrocytes in 20% stretch group was significantly increased （P<0.05）； compared with 20% stretch group， the Ca²⁺ levels in the chondrocytes in 20% stretch+5 μmol·L^-1 PTL group， 20% stretch+10 μmol·L^-1 PTL group， and 20% stretch+ 20 μmol·L^-1 PTL group were significantly decreased （P<0.05）； compared with 20% stretch group， the Ca²⁺ levels in the chondrocytes in 20% stretch+PTL group and 20% stretch+sh-Piezo1 group were significantly decreased （P<0.05）. The RT-qPCR results showed that compared with blank control group and sh-NC group， the expression level of Piezo1 mRNA in the chondrocytes in sh-Piezo1 group was significantly decreased （P<0.05）. The Western blotting results showed that compared with control group， the expression levels of Piezo1 protein in the chondrocytes in 20% stretch group was significantly increased （P<0.05）； compared with 20% stretch group， the expression levels of Piezo1 protein in the chondrocytes in 20% stretch+5 μmol·L^-1 PTL group， 20% stretch+10 μmol·L^-1 PTL group， and 20% stretch+20 μmol·L^-1 PTL group were significantly decreased （P<0.05）； compared with blank control group and sh-NC group， the expression level of Piezo1 protein in the chondrocytes in sh-Piezo1 group was significantly decreased （P<0.05）. Conclusion PTL can inhibit the apoptosis of the chondrocyte induced by high-intensity cyclic mechanical stretch stress， and its mechanism may be related to inhibiting the Piezo1-mediated Ca²⁺ influx-induced apoptosis.

Key words: Parthenolide, Piezo type mechanosensitive ion channel component 1, Mechanical stretch stress, Chondrocytes, Apoptosis

中图分类号:

R681.3

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