N-乙酰半胱氨酸对尼古丁诱导的MC3T3-E1细胞凋亡的作用及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20220104

摘要/Abstract

摘要： 目的

探讨N-乙酰半胱氨酸（NAC）对尼古丁诱导的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞凋亡的影响，并阐明其作用机制。

方法

体外培养MC3T3-E1细胞，采用不同浓度（0、1.0、2.5、5.0和7.5 mmol·L^－1）尼古丁诱导MC3T3-E1细胞损伤，采用MTT法检测各组MC3T3-E1细胞增殖活性，并确定尼古丁半数抑制浓度（IC₅₀）。根据IC₅₀值将MC3T3-E1细胞分为对照组、尼古丁组和尼古丁+不同浓度（2.5、5.0和7.5 mmol·L^－1）NAC组，采用MTT法检测各组细胞增殖活性，以确定NAC最适作用浓度。将细胞分为对照组、尼古丁（4.25 mmol·L^－1）组、NAC（5.0 mmol·L^－1）组和尼古丁（4.25 mmol·L^－1）+ NAC（5.0 mmol·L^－1）组，采用MitoSOX荧光染色法检测各组细胞中线粒体来源活性氧簇（mitoROS）水平，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率，Western blotting法检测各组细胞中凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达水平，并计算Bax/Bcl-2比值。

结果

与0 mmol·L^－1尼古丁组比较，不同浓度尼古丁组细胞增殖活性明显降低（P<0.05），且呈浓度依赖性。尼古丁的IC₅₀值为（4.25±0.03） mmol·L^－1。与对照组比较，尼古丁组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）；与尼古丁组比较，尼古丁+不同浓度 NAC组细胞增殖活性明显升高（P<0.05），尼古丁+5.0 mmol·L^－1 NAC组细胞增殖活性升高最明显。与对照组比较，尼古丁组细胞中mitoROS水平明显升高（P<0.05），细胞凋亡率明显升高（P<0.05），细胞中Bax/Bcl-2比值明显升高（P<0.05）；与尼古丁组比较，NAC组和尼古丁+NAC组细胞中mitoROS水平明显降低（P<0.05），细胞凋亡率明显降低（P<0.05），尼古丁+NAC组细胞中Bax/Bcl-2比值明显降低（P<0.05）。

结论

NAC可缓解尼古丁诱导的MC3T3-E1细胞凋亡，其作用机制可能与线粒体氧化应激有关。

关键词: MC3T3-E1细胞, 尼古丁, N-乙酰半胱氨酸, 细胞凋亡, 氧化应激

Abstract: Objective

To investigate the effect of N-acetylcysteine （NAC） on the apoptosis of mouse MC3T3-E1 preosteoblast cells induced by nicotine， and to clarify its mechanism.

Methods

The MC3T3-E1 cells were cultured in vitro and treated with different concentrations （0， 1.0， 2.5， 5.0 and 7.5 mmol·L^－1） of nicotine to induce the MC3T3-E1 cell injury； MTT method was used to determine the proliferation activities of cells in various groups and the half inhibitory concentration（IC₅₀）of nicotine was determined.The MC3T3-E1 cells were divided into control group， nicotine group， NAC group and nicotine+different concentrations（2.5，5.0，and 7.5 mmol·L^－1） NAC groups according the IC₅₀values， and MTT method was used to determine the proliferation activities of cells in various groups； the optimun concentration of NAC was confirmed.The cells were divided into control group，nicotine （4.25 mmol·L^－1） group，NAC（5.0 mmol·L^－1） group and nicotine（4.25 mmol·L^－1） +NAC（5.0 mmol·L^－1） group.The levels of mitochondrial ROS （mitoROS） was assessed with MitoSOX fluorescence staining method； Flow cytometry was used to detect the apoptic rates of MC3T3-E1 cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression level of apoptosis-related proteins B-cell lymphoma-2 （Bcl-2） and Bcl-2 associated X proteins （Bax）in the cells in various groups， and the ratios of Bax/Bcl-2 was calculated.

Results

Compared with 0 mmol·L^－1 nicotine group， the proliferation activities of MC3T3-E1 cells in different concentrations of nicotine groups were significantly decreased （P<0.05） in a dose-dependent manner. The IC₅₀ of nicotine was （4.25±0.03） mmol·L^－1.Compared with control group，the proliferation activity of MC3T3-E1 cells in 4.25 mmol·L^－1 nicotine group was significantly decreased （P<0.05）； compared with nicotine group， the proliferation activites of MC3T3-E1 cells in nicotine+different concentrations of NAC groups were increased（P<0.05）；the proliferation activity of cells in nicotine+5.0 mmol·L^－1NAC group was the highest. Compared with control group， the levels of mitoROS in the cells in nicotine group was significantly increased （P<0.05）， the apoptotic rate of cells was significantly increased （P<0.05），and the ratio of Bax/Bcl-2 was increased （P<0.05）；compared with nicotine group， the levels of mitoROS in the cells in NAC and nicotine+NAC group were significantly decreased （P<0.05）， the apoptotic rate was significantly reduced （P<0.05），and the ratio of Bax/Bcl-2 in nicotine+NAC group was reduced （P<0.05）.

Conclusion

NAC can alleviate the apoptosis of MC3T3-E1 cells induced by nicotine， and its mechanism may be related to the mitochondrial oxidative stress.

Key words: MC3T3-E1 cells, Nicotine, N-acetylcysteine, Apoptosis, Oxidative stress

中图分类号:

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