环状RNA hsa_circ_0009735对胃癌细胞上皮间质转化、细胞周期和自噬的影响

doi:10.13481/j.1671-587X.20220616

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨环状RNA hsa_circ_0009735在胃癌组织和细胞中的表达，阐明其对胃癌细胞上皮间质转化（EMT）、迁移、细胞周期和自噬的影响。方法取正常胃黏膜GES-1细胞、胃癌MGC-803细胞、MKN-45细胞和HGC-27细胞。将hsa_circ_0009735小干扰RNA和阴性对照转染MGC-803细胞，将胃癌MGC-803细胞分为si-hsa_circ_0009735组和阴性对照组；将对照质粒和hsa_circ_0009735过表达质粒转染入HGC-27细胞，将胃癌HGC-27细胞分为OE-hsa_circ_0009735组和对照质粒组；MGC-803细胞转染细胞自噬质粒pcDNA-eGFP-LC3后分为空白组和不同浓度（0.25、0.50、1.00和2.00 mg·L^－1）雷帕霉素组。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测胃癌组织和细胞中hsa_circ_0009735表达水平，激光共聚焦显微镜观察各组MGC-803细胞形态表现和细胞中自噬小体数，Transwell小室实验检测各组迁移细胞数，流式细胞术检测不同细胞周期各组细胞百分率，Western blotting法检测各组细胞中微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、微管相关蛋白轻链3Ⅰ（LC3Ⅰ）、E-钙黏蛋白、Cyclin D1、Vimentin和N-钙黏蛋白表达水平。结果 PCR产物经测序发现存在环化位点，与hsa_circ_0009735序列匹配。与癌旁组织比较，胃癌组织中hsa_circ_0009735表达水平升高（P<0.05）；与GES-1细胞比较， MGC-803细胞中hsa_circ_0009735表达水平升高（P<0.05）。与空白组比较，0.25和0.50 mg·L^－1雷帕霉素组MGC-803细胞形态无明显改变，1.00 mg·L^－1雷帕霉素组MGC-803细胞中颗粒增多，边界不清；2.00 mg·L^－1雷帕霉素组死亡MGC-803细胞较多。激光共聚焦显微镜下1.00 mg·L^－1雷帕霉素组MGC-803细胞中自噬小体数与2.00 mg·L^－1雷帕霉素组比较差异无统计学意义（P>0.05）。与空白组比较，不同浓度雷帕霉素组MGC-803细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高（P<0.05），hsa_circ_0009735表达水平降低（P<0.01）。与阴性对照组比较，si-hsa_circ_0009735组MGC-803细胞中hsa_circ_0009735表达水平降低（P<0.01），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高（P<0.01），迁移细胞数减少（P<0.01），G₁期细胞百分率升高（P<0.05），S期细胞百分率降低（P<0.01），G₂期细胞百分率降低（P<0.05），细胞中Cyclin D1、Vimentin和N-钙黏蛋白表达水平均降低（P<0.05）；与对照质粒组比较，OE-hsa_circ-0009735组HGC-27细胞中hsa_circ_0009735表达水平明显升高（P<0.01），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P<0.01），迁移细胞数减少（P<0.01），G₁期细胞百分率降低（P<0.01），S期细胞百分率升高（P<0.05），G₂期细胞百分率升高（P<0.05），E-钙黏蛋白表达水平降低（P<0.05），Cyclin D1、Vimentin和N-钙黏蛋白表达水平均升高（P<0.05）。结论胃癌细胞中高表达hsa_circ_0009735可能促进EMT进程，影响细胞迁移和细胞周期，并抑制细胞自噬过程。

关键词: hsa_circ_0009735, 胃肿瘤, 上皮间质转化, 迁移, 细胞周期, 自噬

Abstract:

Methods The GES-1 cells from normal gastric mucosa，gastric cancer MGC-803 cells，MKN-45 cells，and HGC-27 cells were collected. The hsa_ circ_ 0009735 small interfering RNA and negative control were transfected into the MGC-803 cells， and the gastric cancer MGC-803 cells were divided into si-hsa_ circ_ 0009735 group and negative control group；the control plasmid and hsa_circ_0009735 over-expression plasmid were transfected into the HGC-27 cells， and the gastric cancer HGC-27 cells were divided into OE-hsa_circ_0009735 group and control plasmid group， and the MGC-803 cells transfected with autophagic plasmid pcDNA-eGFP-LC3 were divided into blank group and different concentrations （0.25， 0.50， 1.00 and 2.00 mg·L^－1） of rapamycin groups.The expression levels of hsa _ circ_ 0009735 in the gastric cancer tissue and cells were detected by real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR）method；laser confocal microscope was used to observe the morphology of the MGC-803 cells and the number of autophagosomes in the MGC-803 cells in various groups； Transwell chamber experiment was used to detect the number of migration cells in various groups； flow cytometry was used to detect the percentages of the cells at different cell cycles in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of microtuble-associated protein light chain 3Ⅱ（LC3 Ⅱ），microtuble-associated protein light chain 3Ⅰ（LC3 Ⅰ），E-cadherin， Cyclin D1， Vimentin，and N-cadherin proteins in the cells in various groups. Results The PCR products were sequenced and showed cyclization sites，which was matched with the sequences of circ RNA hsa_circ_0009735. Compared with the sequences of adjacent tissue， the expression level of hsa_ circ_ 0009735 in gastric cancer tissue was increased （P<0.05）； compared with GES-1 cells， the expression level of hsa_ circ_ 0009735 in the MGC-803 cells was increased （P<0.05）.There was no significant change of the morphology of the MGC-803 cells among 0.25 and 0.50 mg·L^－1rapamycin groups.Compared with blank group，the number of granules in the MGC-803 cells in 1.00 mg·L^－1 rapamycin group was increased and the boundary was unclear； in 2.00 mg·L^－1 rapamycin group， more MGC-803 cells died. The laser confocal microscope observation results showed that the number of autophagosomes in the MGC-803 cells in 1.00 mg·L^－1rapamycin group had no significant difference compared with 2.00 mg·L^－1rapamycin group （P>0.05）.Compared with blank group， the ratio of LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ in the MGC-803 cells in different concentrations of rapamycin groups were increased （P<0.05）， the expression levels of hsa_circ_0009735 were decreased （P<0.01）. Compared with negative control group， the expression level of hsa_circ_0009735 in the MGC-803 cells in si hsa_ circ_ 0009735 group was decreased（P<0.01）， the ratio of LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ was increased （P<0.01），the number of migration cells was decreased （P<0.01）， the percentage of cells at G₁ phase was increased （P<0.05）， the percentage of cells at S phase was decreased （P<0.01）， the percentage of cells at G₂ phase was decreased （P<0.05）， and the expression levels of Cyclin D1， Vimentin，and N-cadherin proteins in the cells were decreased （P<0.05）； compared with control plasmid group， the expression level of hsa _ circ -0009735 in the HGC-27 cells in OE-hsa_ circ_0009735 group was increased significantly （P<0.01）， the ratio of LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ was decreased （P<0.01）， the number of migration cells was decreased （P<0.01）， the percentage of the cells at G₁ phase was decreased （P<0.01）， the percentage of the cells at S phase was increased （P<0.05）， the percentage of cells at G₂ phase was increased （P<0.05）， the expression level of E-cadherin protein in the cells was decreased （P<0.05）， and the expression levels of Cyclin D1， Vimentin，and N-cadherin proteins in the cells were increased （P<0.05）. Conclusion High expression of hsa_circ_0009735 in the GC cells may promote the EMT process and affect the migration and the cell cycle， and inhibit the autophagy. Objective To investigate the expressions of circular RNA hsa_circ_0009735 in the gastric cancer tissue and cells， and to explore its effects on the epithelial mesenchymal transformation（EMT）， migration， cell cycle，and autophagy of the gastric cancer cells.

Key words: Hsa_circ_0009735, Stomach neoplasms, Epithelial mesenchymal transformation, Metastasis, Cell cycle, Autophagy

中图分类号:

R735.2

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Group	LC3Ⅱ/LC3Ⅰ	hsa_circ_0009735
Blank	0.527±0.091	6.798±0.660
0.25 mg·L^－1 rapamycin	0.973±0.075^*	3.528±2.028
0.50 mg·L^－1 rapamycin	1.143±0.054^*	0.123±0.053^**
1.00 mg·L^－1 rapamycin	1.199±0.022^**	0.054±0.007^**

Group	Percentage of cells
Group	G₁	S	G₂
Negative control	49.470±2.341	25.070±0.933	23.300±1.612
si-hsa_circ_0009735	69.120±2.539^*	15.540±0.955^**	11.820±0.290^*
Vector plasmid	45.610±1.004	20.080±0.566	28.200±1.273
OE-hsa_circ_0009735	25.720±0.690^△△	31.500±1.838^△	34.200±1.414^△

Group	LC3Ⅱ/LC3Ⅰ	E-Cadherin	Cyclin D1	Vimentin	N-Cadherin
Negative control	0.435±0.086	0.951±0.060	0.982±0.026	0.851±0.018	0.967±0.036
si-hsa_circ_0009735	1.273±0.001^**	1.066±0.073	0.368±0.118^*	0.470±0.034^**	0.619±0.016^**
Vector plasmid	1.254±0.001	1.240±0.009	0.609±0.040	0.587±0.005	0.567±0.060
OE-hsa_circ_0009735	1.007±0.015^△△	1.025±0.058^△	0.994±0.078^△	0.969±0.067^△	1.052±0.046^△

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