烟曲霉对人支气管上皮细胞DNA损伤和IL-33表达的影响及其机制

doi:10.13481/j.1671-587X.20240503

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨烟曲霉（Af）对人支气管上皮细胞DNA损伤和白细胞介素33（IL-33）表达的影响，阐明其相关作用机制。方法采用不同浓度（1、5和10 mg·L^-1）Af刺激支气管上皮BEAS-2B细胞，筛选合适的刺激浓度。采用N-乙酰半胱氨酸（NAC）和Af刺激BEAS-2B细胞时，将细胞分为对照组、Af组、NAC组和Af+NAC组。采用DNA双链断裂修复抑制剂NU7441和Af刺激BEAS-2B细胞时，将细胞分为对照组、Af组、NU7441组和Af+NU7441组。采用彗星实验检测各组细胞彗星尾部DNA百分率，采用免疫荧光法检测各组细胞中DNA损伤相关蛋白磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）表达水平，采用2，7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针法检测各组细胞中活性氧（ROS）水平，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中IL-33、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）和白细胞介素25（IL-25）mRNA表达水平，采用Western blotting法检测各组细胞中磷酸化核因子κB（p-NF-κB）、磷酸化共济失调毛细血管扩张突变（p-ATM）和γH2AX蛋白表达水平。结果与对照组比较，1 mg·L^-1Af组细胞中彗星尾部DNA百分率和γH2AX表达水平差异无统计学意义（P>0.05），5 mg·L^-1Af组细胞中彗星尾部DNA百分率和γH2AX表达水平明显升高（P<0.01）；与5 mg·L^-1Af组比较，10 mg·L^-1Af组细胞中彗星尾部DNA百分率和γH2AX表达水平均明显升高（P<0.01）。与对照组比较，1 mg·L^-1Af组支气管上皮细胞中ROS水平明显升高（P<0.05）；与1 mg·L^-1Af组比较，5 mg·L^-1Af组细胞中ROS水平明显升高（P<0.01）；与5 mg·L^-1Af组比较，10 mg·L^-1Af组细胞中ROS水平明显升高（P<0.05）。NAC处理后，与Af组比较，Af+NAC组细胞中彗星尾部DNA百分率（P<0.01）、γH2AX表达水平（P<0.05）和ROS水平（P<0.01）明显降低；NU7441处理后，与Af组比较，Af+NU7441组细胞中彗星尾部DNA百分率明显升高（P<0.01），γH2AX表达水平明显升高（P<0.01）。RT-qPCR检测，NAC处理后，与对照组比较，Af组细胞中IL-33 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）；与Af组比较，Af+NAC 组细胞中 IL-33 mRNA 表达水平明显降低（P<0.05）；NU7441处理后，与Af组比较，Af+NU7441 组细胞中IL-33 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）。Western blotting 法检测，NAC处理后，与对照组比较，Af 组细胞中p-NF-κB、p-ATM和γH2AX蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与Af组比较，Af+NAC 组细胞中p-NF-κB、p-ATM和γH2AX蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。NU7441处理后，与Af组比较，Af+NU7441组细胞中p-NF-κB、p-ATM和γH2AX蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论 Af通过引起人支气管上皮细胞DNA损伤促进细胞中IL-33表达，其机制可能与激活ATM/NF-κB信号通路有关。

关键词: 烟曲霉, DNA损伤, 白细胞介素33, 支气管上皮细胞, 活性氧

Abstract:

Objective To discuss the effect of Aspergillus fumigatus （Af） on DNA damage and interleukin （IL）-33 expression in the human bronchial epithelial cells， and to clarify its related mechanism. Methods Different concentrations （1， 5， and 10 mg·L?1） of Af were used to stimulate the bronchial epithelial BEAS-2B cells to select the appropriate stimulation concentration. When the BEAS-2B cells were treated with N-acetylcysteine （NAC） and Af， the cells were divided into control group， Af group， NAC group， and Af+NAC group. When the BEAS-2B cells were treated with DNA double-strand break repair inhibitor NU7441 and Af， the cells were divided into control group， Af group， NU7441 group， and Af+NU7441 group. The comet assay was used to detect the percentages of comet tail DNA of cells in various groups； immunofluorescence method was used to detect the expression levels of DNA damage-related protein phosphorylated H2AX（γH2AX） in the cells in various groups； 2，7-dichlorofluorescein diacetate （DCFH-DA） fluorescence probe was used to detect the levels of reactive oxygen species （ROS） in the cells in various groups； real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to detect the expression levels of interleukih-33 （IL-33）， thymic stromal lymphopoietin （TSLP）， and interleukih-25 （IL-25） mRNA in the cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of phosphorylated nuclear factor κB （p-NF-κB）， phosphorylated ataxia telangiectasia mutated （p-ATM）， and γH2AX proteins in the cells in various groups. Results Compared with control group， the percentage of comet tail DNA and the expression level of γH2AX in the cells in 1 mg·L?1 Af group showed no significant difference （P>0.05）， while the percentage of comet tail DNA and the expression level of γH2AX in the cells in 5 mg·L?1 Af group were significantly increased （P<0.01）； compared with 5 mg·L?1 Af group， the percentage of comet tail DNA and the expression level of γH2AX in the cells in 10 mg·L?1 Af group were significantly increased （P<0.01）. Compared with control group， the ROS levels in the bronchial epithelial cells in 1 mg·L?1 Af group was significantly increased （P<0.05）； compared with 1 mg·L?1 Af group， the ROS level in the cells in 5 mg·L?1 Af group was significantly increased （P<0.01）； compared with 5 mg·L?1 Af group， the ROS level in the cells in 10 mg·L?1 Af group was significantly increased （P<0.05）. After treatment of NAC， compared with Af group， the percentage of comet tail DNA （P<0.01）， the expression level of γH2AX （P<0.05）， and the ROS level （P<0.01） in the cells in Af+NAC group were significantly decreased； after treatment of NU7441， compared with Af group， the percentage of comet tail DNA and the expression level of γH2AX in the cells in Af+NU7441 group were significantly increased （P<0.01）. The RT-qPCR results showed that after treatment of NAC， compared with control group， the expression level of IL-33 mRNA in the cells in Af group was significantly increased （P<0.05）； compared with Af group， the expression level of IL-33 mRNA in the cells in Af+NAC group was significantly decreased （P<0.05）； after treatment of NU7441， compared with Af group， the expression level of IL-33 mRNA in the cells in Af+NU7441 group was significantly increased （P<0.05）. The Western blotting results showed that after treatment of NAC， compared with control group， the expression levels of p-NF-κB， p-ATM， and γH2AX proteins in the cells in Af group were significantly increased （P<0.05）； after treatment of NU7441， compared with Af group， the expression levels of p-NF-κB， p-ATM， and γH2AX proteins in the cells in Af+NAC group were significantly decreased （P<0.05）； After treat ment of NU7441， compared with Af group， the expression levels of p-NF-κB， p-ATM， and γH2AX proteins in the cells in Af+NU7441 group were significantly increased （P<0.05）. Conclusion Af promotes the IL-33 expression in the human bronchial epithelial cells by causing DNA damage， and its mechanism may be related to the activation of ATM/NF-κB signaling pathway.

Key words: Aspergillus fumigatus, DNA damage, Interleukin-33, Bronchial epithelial cell, Reactive oxygen species

中图分类号:

R392.12

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